干燥滅菌器用于剪接異構(gòu)體克隆優(yōu)化！！！

    PKR的dsRBD能夠與5′端三磷酸 的單鏈RNA結(jié)合并引起PKR的活化，但其研究并沒 有排除這種結(jié)合是否有鏈接區(qū)的參與 。MAYO 等最新研究認(rèn)為，PKR與單鏈RNA的結(jié)合是由于 鏈接區(qū)有一段富含堿性氨基酸的 Basic Region 的作 用。富含堿性氨基酸的區(qū)域帶較多正電荷，能夠與 單鏈 RNA 帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)結(jié)合，并由此促進(jìn) KD的二聚化和活化。Taq DNA 聚合酶、Prime? star DNA 聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶（Xho I 和 EcoR I）、DL2000 Marker 購于 TaKaRa 公司；瓊脂糖 （Agarose）、無水乙醇、異丙醇、DEPC（焦碳酸二乙 酯）均購于上海生工生物工程有限責(zé)任公司。RNA 提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于 TaKaRa 公司。 美國ABI公司PCR儀、美國Thermo公司微型高速離 心 機(jī) 、上 海 博 迅 立 式 壓 力 蒸 汽 滅 菌 器（XQ-LS100G）、蘇州凈化超凈工作臺(tái)（SW-CJ-ED）、杭州奧 盛三聯(lián)多用途金屬浴、上海天能EPS300電泳儀等。

    在斑馬魚基因組內(nèi)，雖然同時(shí)存在等位基因 ZPKRa（基因登錄號：AM421526. 1）和 ZPKRb（基因 登錄號：AM421527. 1），但兩者的核苷酸序列相差很 小，氨基酸序列則只有5個(gè)氨基酸的差異，且都不在 關(guān)鍵的位點(diǎn) 。除此之外，本研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚細(xì)胞 內(nèi) 還 同 時(shí) 存 在 ZPKR 和 ZPKRV（基 因 登 錄 號 ： MH425504. 1）兩種不同結(jié)構(gòu)的PKR的表達(dá)，ZPKRV 僅僅在鏈接區(qū)缺失28個(gè)氨基酸殘基，其中包含缺失 鏈接區(qū)內(nèi)的功能模體堿性區(qū)。斑馬魚體內(nèi)這2種PKR的轉(zhuǎn) 錄表達(dá)，其翻譯表達(dá)的產(chǎn)物將在刺激后24 h共存于細(xì) 胞內(nèi)，通過顯性的負(fù)效應(yīng)，可能減弱其PKR上調(diào)后對 蛋白翻譯的抑制作用。事實(shí)上，qPCR結(jié)果顯示， 在Poly I：C刺激后的24 h，ZPKRV表達(dá)達(dá)到峰值，并 且 ZPKR和 ZPKRV的比值最小，為 3. 08。這時(shí)兩者 的相互作用產(chǎn)生的顯性負(fù)效應(yīng)最大，對蛋白翻譯抑制 作用最小。